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自2015年之后，規?；B豬場診斷實驗室逐漸配置了分子生物學診斷設備（從早期的PCR逐漸過渡到qPCR），尤其是2018年非洲豬瘟之后，為了快速診斷與精準剔除，紛紛配置了熒光定量檢測設備，用于潛在感染病原的分子生物學快速、精準的診斷（尤其是非洲豬瘟、藍耳病等），今天跟各位聊聊分子生物學檢測過程中的一些基本概念，檢測結果應用等，便于各位臨床獸醫對實驗室結果的解讀與綜合診斷應用。
本文重點在第三部分。
一、qPCR、CT值等一些基本概念
1 qPCR檢測的原理
以基因的cDNA為模板進行PCR擴增，在PCR擴增過程中，通過收集熒光信號，對PCR進程進行實時檢測。檢測的Ct 值和該模板的起始拷貝數的對數之間存在線性相關。普通PCR是定性的檢測方法，而qPCR（又稱為 real time PCR）是半定量檢測方法。
2 Ct值是什么？
非洲豬瘟之后，因為qPCR技術的廣泛應用，行業人士都知道了“CT值”一詞，也知道了“起峰”的基本含義。但什么是CT值呢？
qPCR擴增過程中，擴增產物的熒光信號達到設定的熒光閾值時所對應的擴增循環數（Cycle Threshold）。C代表Cycle，T代表Threshold。CT值越小，代表初始模板中目標基因的濃度越高；CT值越高，代表初始模板中目標基因的濃度越低，通常CT值的合理范圍是15-35之間。
3 基線（Baseline）
是指在PCR擴增反應的最初數個循環里，熒光信號變化不大。接近一條直線，這樣的直線即是基線。所以在qPCR的結果圖中，若試劑盒或反應體系較好的話，前面的圖形應該是直線。
4 熒光域值（threshold）的設定
一般將PCR反應前15個循環的熒光信號作為熒光本底信號，熒光域值是PCR第3-15個循環熒光信號標準差的10倍，熒光域值設定在PCR擴增的指數期。
qPCR擴增產物量是以熒光信號的形式直接呈現，也就是擴增曲線。在PCR早期，擴增處于理想情況下，循環數較少，產物積累少，產生熒光的水平不能與熒光本底背景明顯地區別，之后熒光的產生增加進入指數期。
在PCR的后期，擴增曲線不再呈現指數擴增，進入線性期和平臺期。
5 Ct值的重現性
PCR循環在到達Ct值所在的循環數時，剛剛進入真正的指數擴增期，此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現性極好，即同一模板在不同時間擴增或同一時間不同管內擴增（有時候會受到八連管的質量，反應體系的混合均勻度，加樣的操作等影響），得到的Ct值是恒定的。
通常認為，CT值的重現性受到人工操作、提取效率、擴增效率等影響，也是檢測提取試劑盒與擴增試劑盒品質的關鍵性指標之一。
也可以使用同一份樣品在不同實驗室的CT值的重現性來驗證不同實驗室之間的檢測能力的差異性。若樣品是標準品更佳（維特康實驗室出售實驗室驗證用標準品，若需要，請聯系）。
二、CT值與病毒載量的關系
在很多情況下，我們更需要知道病毒載量，以判斷豬群的發病階段或感染壓力。
1 什么是病毒載量？
病毒載量(viral load，VL)代表的是某一載體中病毒負荷量，比如血液中的病毒載量（病毒血癥）即指的血液中病毒負荷量。對于具有病毒血癥的病原來講，血液中病毒載量的高低是衡量疾病進展的標志，對疾病的傳播能力、發展階段、分期預后估計、療效觀察均有很高的參考價值。
很多疾病的病毒血癥期很短，比如PRRSV病毒在成年豬體內的病毒血癥期只有7-10天左右。也就是說，感染成年豬7-10天之后，血液中的病毒載量可能是0，但病毒載量是零，并非意味著豬只不攜帶病毒，可能在組織內依然存在病毒。研究表明：不同毒力的非洲豬瘟病毒的病毒血癥期差異也較大，通常認為，毒力越弱，病毒血癥的持續期越短，病毒血癥在感染后的呈現時間約晚。
2 病毒載量與CT值之間的關系什么？
病毒載量多少可以通過qPCR方法進行測量，是以拷貝（copies）為單位，計算每一毫升（ milliliter）有多少病毒量，如 copies/ ml，通過建立的標準曲線通常以CT值表示。各模板的CT值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系，起始拷貝數越多，CT值越小。反之亦然。qPCR檢測到的僅為病毒核酸的多少（可能是死亡的病毒核酸片段），其并不能完全代表感染力大小，若要明確病毒的感染力則需要進行細胞或動物活體實驗（病毒活力/毒價一般用TCID50/mL（比如PRRSV）、HAD（比如ASFV）等表示）。臨床生產中，用qPCR方法對血液、組織處理液、唾液、組織中的病原進行核酸檢測，可以反映體內病毒復制（病毒數量）情況；用qPCR方法對車輛、人員、物資等環境樣品進行檢測，可以反映樣品曾暴露（接觸）過病原的情況，是否具有感染活力或者傳播性，則需要通過細胞培養的方式進一步評估，其更重要的意義體現在生物安全風險的評估、疾病暴發的提前預警以及疾病暴發后的溯源。
CT值與病毒載量的線性關系與樣品的提取效率、擴增效率、樣品種類、探針引物、反應體系等多因素相關。需要在實驗室內，使用某一固定品牌或品類的診斷試劑，通過批內、批間實驗進行不斷優化，針對已知病毒含量（一般為質粒）的擴增模板，描繪出標準曲線，從而推斷出特定CT值所對應的病毒含量。
3 為何有時病毒檢測結果為“測不到”？
每一種檢測方法都有檢測閾值（敏感性），比如qPCR方法檢測血液或其他樣品中某一種病毒的數量其最低值是50 copies/ml，則任何血液樣本或其他樣品中該病毒的載量低于這門坎表示病毒量低于可測量的限度，報告中一般顯示低于測量值，就是說“測不到”。這并不表示血液或其他樣品中沒有病毒，而是病毒量在0與50 copies/ml之間，因數量太低，儀器無法測出。但是，血液“測不到”的病毒還是會廣泛存在于精液、陰道分泌物、骨髓、內臟中，可能豬只依然具備傳播性，從而傳播疾病，如：藍耳病毒、非洲豬瘟病毒等。
根據檢測方法的不同，病毒載量的單位常為：copies/mL，或 TCID50/mL。
4 Ct值的正常范圍是多少？
Ct值的范圍為15-35。Ct值小于15，認為擴增在基線期范圍內，未達到熒光閾值。理想情況下，Ct值與模板起始拷貝數的對數存在線性關系，也就是標準曲線。通過標準曲線，擴增效率為100%時，計算出基因單個拷貝數定量的Ct值在35左右，若大于35，理論上模板起始拷貝數小于1，可認為無意義。
對于不同的基因Ct范圍，因起始模板量中基因拷貝數和擴增效率不同，需做出該基因的標準曲線，計算出基因的線性檢測范圍。
對于CT值大約35的結果解讀：在實際檢測過程中，環境樣品、非洲豬瘟疫苗毒感染樣品等，因為病毒含量較低，可能會出現CT值大于35的結果（CT值在35-40之間），這種結果的臨床解釋要謹慎，需要認真考慮樣品的種類、豬只臨床表現及對結果重復采樣檢測后的重復性等。對于CT值在35-40之間的結果，往往重復檢測時，重復性較差。
5 復孔間重復性差
為了增加檢測結果的可靠性，我們可以對同一樣品設定復孔進行檢驗。
首先，談談復孔間重復性差的問題，復孔間重復性差一般會有以下兩種情況：
（1）Ct值＜30，重復性較差。這種情況與操作有一定關系。
這種情況可以從以下幾個方面分析：加樣準確度、移液器吸取液體的準確度、定期校準qPCR儀。
a. 加樣準確度
避免小體積加樣，減少加樣誤差?？梢詫⒁?、SYBR Green Mix或Probe Mix、ddH2O配置成混合體系，并且增加模板的稀釋梯度，大體積加樣。如：原液cDNA添加1μL，可以更改為原液cDNA稀釋5倍，添加5μL，使用 ddH2O補齊體系至20μL即可。
SYBR Green Mix或Probe Mix、配置的混合體系需要混合均勻。從-2℃0 ℃ 冰箱拿出的試劑需要完全融化并上下顛倒徹底混勻；配置體系時，將混在一起的Mix用移液器吹打混勻。
b. 移液器吸取液體的準確度
移液器量程定期校準，校準周期為1年。
購買與移液器配套的槍頭，若槍頭與移液器不匹配，在吸取液體時易出現漏氣的現象，導致吸取量程不準確。
在吸取相同量程的液體體積時，注意觀察每次吸取液體在槍頭內的液面高度是否一致。
C. 定期校準PCR儀
一般每一年都需要對PCR儀校準一次。
（2）Ct值＞30，重復性差。這種情況符合松柏分布，即在有效模板很少的情況下，模板與引物的碰撞存在隨機性，直接導致復孔間的Ct值差異較大。
三、CT值與病毒載量的臨床診斷與緊急處置應用
通過CT值，只能粗略的判斷樣品中病毒載量的大小，通常正常范圍的數值是15-35之間。若CT值在15-20之間，說明樣品中目標基因片段的含量很高。這對于圓環病毒病的致病性診斷有指導性意義。對于感染非洲豬瘟的豬的血液與組織樣品的CT值通常在20-30之間，若CT值過高（如：30-40之間），或者疾病處于早期，或者需要鑒定是否是因為非洲豬瘟弱毒（變異毒株感染）感染所導致的。
一般而言，對于多數病原而言，血液的CT值最低，病毒含量最高，唾液樣品中的CT值要稍低些，而環境、物資、人體等樣品的檢測CT值一般比較高，說明病毒含量比較低。故作為臨床獸醫或生物安全管理者，不能單純的依照qPCR的CT值來判斷物資或人員是否有傳染病毒的風險?？赡苁且驗闃悠分械牟《竞枯^低，但可能依然具備感染性，提示我們必須認真的做好生物安全措施。
qPCR給非洲豬瘟、新冠病毒的防控、緊急處置提供了非常大的幫助，但不能以qPCR的結果作為豬群是否感染的唯一標志。筆者曾經遇到一個案例，連續5天豬剩料，但qPCR檢測結果始終檢測陰性（臨床與實驗室檢測結果出現不一致性！請參考2021年2月份文章：精準拔牙只靠testing嗎？），但第6天，尾根血拭子的qPCR值是20-25之間，這也說明拔牙不能只靠qPCR檢測，通常需要結合臨床表現+實驗室檢測結果綜合判斷非洲豬瘟的感染風險。
其實圓環病毒感染的診斷依據類似（臨床癥狀+病變+檢測的病毒含量）。因為圓環病毒感染的廣泛性，需要在組織樣品中檢測到高含量的圓環病毒，并出現圓環相關的臨床癥狀，結合仔豬的圓環免疫狀態，才能做出最終綜合診斷。
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